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高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起，世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病
依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。
本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(2000年版)，并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。
本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录
本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出人境检验检疫局提出。
本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。
本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。
本标准起草人:单松华、陈家华、谢燕、杨锡全、倪旦红、刘乐庭、刘俊平。
1 范围
本标准规定了NASBA快速检测H5亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定
本标准适用于禽类、禽肉产品中H5亚型禽流感病毒的快速检测、诊断
2 规范性引用文件
下 列 文 件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB /T 1 8936一2003 高致病性禽流感诊断技术
3 原理
NA SB A (Nucteica cids equence-baseda mplification, NASBA.依赖核酸序列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H,噬菌体I7核糖核酸聚合酶)和两条寡核普酸引物上游引物5‘末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的
启动子序列，下游引物的5‘末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列口在扩增步骤中，两个三‘端都整合进扩增序列中，这样既成为产生互补RNA序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECI探针。扩增底物与ECI，探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECI.)反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。
4 材料准备
4.1 试验环境
干 净 的 环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区
4.2 器材
采用 常 规 的分子生物学器材，包括:一次性手套、移液器(量程5p L到200讨)、枪头、无RNA酶的1.5 m l,塑料离心管、1.5 m l_离心管架、5m工一试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精度士20C)、加热器、水浴锅,5 m工聚丙烯试管(VWR)、封口膜等
如果 采 用 ECI_方法，需要NuctiSens阅读器或者等同的仪器。
如果 采 用 ELISA方法，需要酶标仪。
4. 3 引物
上 游 引 物AAT TCT AAT ACG ACT CAC TA丁AGG GAG AAG G CCA IAA AGA (C/丁)AG
ACC 八GC TA
下 游 引 物GA下GCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA GAA GAA GAA AAA八GA GAG GAC
4.4 检测试剂
所 有检 测 试剂在使用前，使其达到室温。
a) 裂 解 缓冲液:5m ot/L异硫氰酸肌,10%TritonX -100,10m mol/I,Tris-HCI,pH 8.3;
b) 冲 洗 缓冲液:5m ot/L异硫氰酸K,]Ommot/LTris-HCI,pH 8.3;
c) 5 00 m g/-l、硅土500m g/ml盐酸活化的二氧化硅;
d) 洗 脱 缓冲液:10m mol/I.T ris-HCI,pH 8.3 ;
e) 酶 溶液(参见附录A);
f) H 5 捕捉探针:10m mol/I生物素化寡聚核昔酸;
探针 序 列 为Biotin-GC(A/G)A GT TC(C/T)C TA GCA CTG GCA AT
g) 电 化 学发光法属别检钡U探针(10m MgenericE CI_d etectionp robe):钉标记的DNA寡聚核昔酸 ;
ECI 序 列为GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG GT GA (C/T) AAT GAA TG (C/T)
ATG GAA
h) 仪 器 调试参照液:10m mol/LN ASBA CP;1 m mol/LT ris-HCIp H8.3 ;3 m mol/LN ASBAECI ;
I) 检 测 稀释液:15m mol/-1T ris-HC1,pH 8.3;
i) 分 析 缓冲液:50m mol/LT ris-HCI,pH 8.3;1XPBS(137m mol/LN aCl,2 .7m mol/LK CI,1 0
mm o l/ L N a,H P O,，2m mol/L KH2PO,);
k) 清 洗 液:100m mol/LK OH,10%SDS,10% TritonX -100;
1) 无 水 乙醇
4.5 样品采集、保存、处理
按 G B/ T 18936-2003中2.1进行
5 操作方法
5. 1 核酸释放和提取
按 以 下 顺序:
a) 将 。.1 m 工J样品加人盛有0.9 m L裂解缓冲液的管中并振荡混合;
b) 振 荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人50p L;
C) 振 荡 混合均匀;
d) 室温 下温育10m in(每2m in振荡混合一次，防止硅土沉淀);
e) 在 120 00r /min下离心裂解缓冲液管30、;
f) 小 心 移除上清液(不要搅动沉淀)后，向每个管中加人1m L冲洗缓冲液;
9) 振荡 混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止;
h) 在 120 00r /min下离心30、，然后移除上清液;
i) 重 复 第f)步到第h)步的步骤依次为一次使用冲洗缓冲液;两次使用70%乙醇;最后一次使
用 10 0% 乙 醇 ;
J) 最 后 一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙醇;
k) 使用 加热器在56℃敞口干燥硅土10m in(用薄纸覆盖每个管避免污染);
I) 十 燥 后向每个管加人50p L洗脱缓冲液;
m) 振 荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮;
n) 56 ℃温育硅土悬浮液10m in以洗脱核酸(5m in后开始振荡试管);
0) 在 120 00r /min下离心2m in;
p) 将 5川核酸上清液转移至新试管，在1h内开始扩增反应
以上 步 骤 也可采用Qiagen或者等同的其他试剂盒进行。
5.2 核酸扩增
按 以 下 顺序:
向上述5 pL核酸[5.1 p)]中加人10川扩增试剂(参见附录A);
65 C温育5 min;
a) 切
c) 4 10C 温育5m in;
d) 加 人 5川酶溶液(参见附录B)，并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀;
e) 放 回 试管，并继续在41''C温育5m in;
f) 将 试 管稍作离心后，在410C 温育90m in;
9) 检 测扩增产物;
h) 在 一 70℃下保存扩增产物不超过30d
5.3 核酸检测
按照 以 下 步骤或用ELISA进行检测:
a) 将 ( N"+2)个5m l聚丙烯试管进行编号。试管1作为空白对照;
b) 振 荡 混合，除了试管1外，其余试管各加人20y L杂交溶液(参见附录C)
c) 试 管 2中加人5M L检测稀释液作为空白对照;
d) 其 余 试管各加5p LRNA扩增产物;
e) 封 口 膜封住所有试管，振荡混合;
f) 所 有 试管410C 温育30m in。每10m in混合一次;
B) 除 了 试管1外，其余试管各加人。.3 m L分析缓冲液;
h) 振 荡 仪器调试参照液直至不透明，然后加0.2 5m LI RS到试管1;
i) 把 试 管放在转盘式传送盘的适当位置上;
J) 运 行 NucliSens阅读器，对数据进行分析和解释(参见附录n)a
6 结果判定
通过 大 量 分析已知阴性对照样品后，确定NASBA/ECI的临界值为。.15X仪器参照溶液的数值
样品的读数超过临界值时，判为H5亚型禽流感病毒阳性，低于临界值时，判为H5亚型禽流感病毒
阴性
1) N为样品数
GB/T 19439-2004
附 录A
(规 范性附录)
扩增试剂的配制
A. 1 酉己制材料
球状骨针:单个球状骨针为10 mg,4 mmol/l. NTP,15 rnmol/L DTT,40 mmol/L MgCl2
球状骨针稀释剂;100 mmol/L Tris-HCI pH8. 3, 2 mmol/L dNTP;
100 mmol/I氯化钾溶液;
10 mmol/I, HS引物混合物;
DEPC水
A.2 配制过程
a) 单个球状骨针中加人80夙球状骨针稀释剂，并迅速振荡均匀;
b) 稀释的球状骨针中加人16川氯化钾溶液和14越DEPC水，振荡均匀
c) 加人10川JH5引物混合物，振荡混合;
d) 不能离心;
e) 在30 min内使用
附 录B
(规范性附录)
酶溶液的配制
B 1 配制材料
a) 酶 球 :单个酶球(6.5m g)含1.3U /kLA MV-RT,0.5 U /kLR NaseH ,1.3U/pLT 7R NA聚
合酶,100 mmol/L Tris-HC1,pH 8.3,10%BSA;
b) 酶 球 稀释剂:0.4 2p g/川JBSA.
B.2 酶溶液的制备
单个酶球中加人55 pL酶稀释液，将此溶液放置室温至少20 min;
用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解;
不能剧烈振荡任何含酶的溶液;
使用前，稍作离心;
在60 min内使用
附 录C
(规 范性附录)
杂交溶液的配制
C. 1 配制材料
a) H5捕捉探针:10m mol/I生物素化寡聚核营酸;
GB/T 19439-2004
b) 电化学发光法属别检测探针(10 mMgeneric ECL detection probe):钉标记的DNA寡聚核
普 酸 。
C.2 杂交溶液制备
振荡HS捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。
对于N次特异性检测反应，在新试管中混合(N+2)X10 pL H5捕捉探针和(N+2)X10川
ECI探针
使用前稍作振荡
在60 min内使用。
附 录 D
(资 料 性 附 录 )
NucliSens阅读器的操作运行
D. 1 建立一个新的运行程序。
D.1.1 打开NucliSens阅读器的个人电脑。
D. 1. 2 在开始界面点击“Prime"来执行系统校准
D.1.3 机器准备好后，点击“Start" 校准步骤大约持续3 min,
D.1. 4 在登人(log-in)界面的用户名(usern ame)上选择“Servicee ngineer''，并且点击“Login''， 不需要
输人密码。
D. 1. 5 在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“New run"
D. 1. 6 在弹出的工作表界面点击“yes",
D. 1. 7 输人文件名(不超过8个字符)并且点击“ok".
D.1. 8 一个工作表单会打开，在分析选择栏(selecteda ssay)选择“Freet ube".
D. 1.9 输人样品号并且点击“Add to list"
D.1.10 重复上述步骤直到输人所有样品ID.
D. 1. 11 输人所有样品号后，点击“Close"键
D.1.12 屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表，检查无误后点击“ok"o
D.2 确定样品放在转盘式传送盘(instrumentc arousel)上，并且按照计算机中输人的样品ID顺序
摆放
D.3 在屏幕上方选择“Routine”菜单，然后点击“Runw orklist"o
D.4 出现一个检查弹出窗口，点击“Proceed".
D.5 检测开始(每个试管用时大约l.5 min)o D.6 检测停止后，在屏幕左上方选择“Routine”菜单，然后点击“Sampler esults”或者“Assayr esult"显示结果。 |