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1 范围
本标准规定了牛病毒性腹泻粘膜病(BVD/MD)的诊断技术要求。
本标准适用于BVD/MD的流行病学调查和检疫。
2 定义
本标准采用下列定义。
细胞玻片
放置在莱顿氏(Leighton’s)管或其他用作培养细胞的小瓶中，长有单层细胞的盖玻片。
3 BVD/MD病毒分离与鉴定
3.1 材料准备
3.1.1 阳性参照毒株为牛粘膜病病毒俄勒冈毒株(OregonC24V)。
3.1.2 BVD/MD荧光抗体(BVD/MD—FA)、阳性血清。
3.1.3 荧光显微镜：
采用蓝紫光为激发光的透射式或落射式荧光显微镜。
3.1.4 犊牛(或胎牛)血清：
无BVD/MD抗体和无污染。
3.1.5 细胞培养瓶扁瓶、Leighton’s管、0.17mm厚度的盖玻片(1.0cm×3.8cm或0.8cm×2.4cm)，0.8mm一1.0mm厚的普通玻璃载片，带盖湿盒。
3.1.6 溶液配制：
Ph7.0—7.2 0.0lmol/L磷酸盐缓冲液，pH9.0—9.5 0.5mol/L碳酸缓冲甘油[见附录A(标准的附录)]。
3.1.7 细胞培养液：
见附录B(标准的附录)。
3.1.8 原代细胞培养物：
见附录C(标准的附录)。
3.2 病毒分离
3.2.1 样品的采集
3.2.1.1 对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。
3.2.1.2 对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采血或鼻分泌物。
3.2.1.3 对流产、死胎，采胎儿的组织。
3.2.1.4 对怀疑为死于粘膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已发生自溶，可采扁桃体或淋巴结。
3.2.2 样品处理
3.2.2.1 血液用常规方法分离血清。
3.2.2.2 凝血块：
冻融数次后，取析出的上清液(加入适量的双抗即青链霉素)。
3.2.2.3 组织样品用含1000IU/mL，双抗的细胞培养液作1：10倍的乳剂，离心取上清液。
3.2.2.4 精液冻融3次(或超声波裂解处理)，用细胞培养液作1：10倍稀释，离心取上清液。
3.2.2.5 鼻分泌物：
用含1000IU(mg)/mL双抗①的培养液4倍稀释后，离心取上清液。
以上各样品处理后均需作无菌检验。
3.2.3 样品的接种培养
3.2.3.1 将l0mL牛睾丸原代细胞(见附录C)接种于小扁瓶，置37℃静止培养。培养到细胞形成80％以上单层。
3.2.3.2 取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培养液，接种3.2.2.1～3.2.2.5的样品，每瓶接种样品lmL，每份样品接种3瓶。
3.2.3.3 置37℃吸附2h一3h。
3.2.3.4 吸附后，将样品倒去，加维持液[见附录B中B1，另加3％犊牛血清(3.1.4)]10mL置37℃恒温培养。
3.2.3.5 培养6d后，将其冻融3次，收集3瓶细胞及其培养基，混合后即为样品分离细胞培养物。
3.3 样品分离物的病毒鉴定
3.3.1 分离物的细胞玻片培养
3.3.1.1 将lmL牛睾丸原代细胞悬液，接种于带盖玻片(3.1.5)的Leighton’s管，置37℃培养，至盖玻片上细胞生长成80％的单层。
3.3.1.2 取3.3.1.1中4个Leighton’s管，倒去培养液，每瓶接种3.2.3.5中样品分离细胞培养物lmL。
3.3.1.3 置37℃吸附2h一3h。
3.3.1.4 吸附后，加维持液lmL，置37℃恒温培养3d。
3.3.1.5 取出细胞玻片，用磷酸盐缓冲液(见附录A中A1)轻轻漂洗，倾去液体自然干燥。用纯丙酮室温固定10min一15min。
3.3.1.6 取各组固定后的细胞玻片(样品组取半数，余者在必要时作抑制染色试验用)，置湿盒内，细胞面向上，滴加BVD/MD—FA(3.1.2)，并使免疫荧光抗体(FA)铺满而又不溢出于细胞面。将湿盒盖盖严。置37℃染色2h。随后取出，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，倾去液体。
3.3.1.7 封片：
将细胞面向下，用碳酸盐缓冲甘油(见附录A中A2)封贴于载玻片上。
3.3.2 对照
3.3.2.1 阳性参照组：
取3.3.1.1中带有细胞玻片的Leighton’s管2管，每管接种0.1ml 100TCID50的(OregonC24V(3.1.1)，此后按3.3.1.3—3.3.1.7方法操作。
3.3.2.2 阴性对照组:
取3.3.1.1中带细胞玻片的Leighton’s管2管，按3.3.1.5～3.3.1.7方法操作。
3.3.3 镜检
3.3.3.1 被BVD／MDV感染的细胞，在蓝紫光激发的荧光显微镜下，胞浆呈黄绿色的荧光，非常见有闪烁明亮黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。未感染细胞无荧光。
3.3.3.2 荧光观察记录:
荧光在激发光照射下，随时间延长而明显减弱，因此在染色后，应尽快镜检及时记录，记录可分为：
a)(-)无荧光；
b)(+)荧光微弱，形态不清晰；
c)(++)荧光较亮，形态清晰；
d)(+++一++++)荧光较强，明亮闪烁，形态清晰。
3.3.4 荧光抑制试验
3.3.4.1 取3.3.1.6中固定后余下的细胞玻片，滴加BVD/MDV的阳性血清(3.1.2)，置37℃作用1h后，用磷酸盐缓冲液充分洗涤3次。
3.3.4.2 此后按3.3.1.6～3.3.1.7中规定进行操作。
3.3.4.3 判定:
在抑制试验中，荧光被BVD/MD的阳性血清所抑制，则判定原样品分离物的荧光为BVD／MD病毒抗原特异荧光。
3.3.5 终判定
当阴性对照为(—)，阳性参照为(+++)以上，抑制试验对照片荧光被抑制，被检组为3.3.3.2中c)和d)时判为分离病毒阳性；为3.3.3.2中b)者应重检，重检后仍为3.3.3.2中b)者，则判阳性；被检组为3.3.3.2中a)者，判阴性。当阳性参照不出现特异荧光，为无结果，应予重检。
4 微量血清中和试验
4.1 材料准备
4.1.1 标准毒株 Oregon C24V。
4.1.2 标准阳性血清、标准阴性血清。
4.1.3 细胞：
可用犊牛原代肾细胞、睾丸细胞和鼻甲细胞(见附录C)或牛鼻甲细胞系(MDBK)细胞。
4.1.4 培养基
4.1.4.1 稀释液营养液，pH7.0—7.2，每毫升加100mg链霉素和100IU青霉素，按说明书配制。
4.1.4.2 生长液
营养液加10％犊牛血清(3.1.4)。
4.1.4.3 维持液
营养液加2％—5％犊牛血清。
4.1.5 被检血清
无菌静脉采血，常规分离血清，56℃灭活30min。
4.1.6 微量细胞培养板(简称微量板)96孔平底板。
4.1.7 加样器，单通道或多通道的可调加样器。
4.2 操作程序
4.2.1 定量测定
4.2.1.1 用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液(4.1.4.1)50uL。
4.2.1.2 用单通道加样器取50uL灭活的被检血清加于微量板的第一排孔中，每份样品加4个孔。
4.2.1.3 用多通道加样器(调至50uL)从第一排孔开始作连续倍比稀释、直至最后一个孔，并从最后孔中弃去50uL稀释物。
4.2.1.4 用稀释液将标准毒株 OregonC24V(4.1.1)稀释成含100TCID50/50uL的工作液。
4.2.1.5 用多通道加样器从第二排孔开始每孔加病毒工作液50uL，第一排孔中加50uL稀释液作为被检血清毒性对照。
4.2.1.6 将微量板盖严，置于37℃5％二氧化碳培养箱中中和2h～3h。
4.2.1.7 将细胞悬液(见附录C)100uL加到微量板各孔中，或将生长成良好单层的细胞用EDTA—胰酶消化液消化分散后，用生长液(4.1.4.2)配制成含40万/mL的细胞悬液加到微量板的各孔中，每孔100uL。
4.2.1.8 按4.2.1.6中方法培养6d, 从第四天开始观察结果，并于第6d作终判。
4.2.1.9 试验需作下列对照：
a)阳性血清(4.1.2)对照：2倍稀释血清50uL+50uL病毒工作液+100uL细胞悬液。
b)阴性血清(4.1.2)对照：2倍稀释血清50uL+50uL病毒工作液+100uL细胞悬液。
c)正常细胞对照：细胞悬液100uL+维持液100uL。
d)病毒用量滴定：将病毒工作液用稀释液作三次10倍递进稀释取：
1)病毒工作液100TCID50/50uL：50 uL+稀释液50 uL+细胞悬液100/uL；
2)10-1病毒工作液10TCID50/50uL：50uL+稀释液50uL+细胞悬液100uL；
3)10-2病毒工作液1TCID50/50uL：50uL+稀释液50uL+细胞悬液100uL；
4)10-3病毒工作液0TCID50/50uL：50uL+稀释液50uL+细胞悬液100uL。
以上各对照均作4个孔。
4.2.2 定性试验
4.2.2.1 用多通道加样器于96孔微量板中每孔加稀释液40uL。
4.2.2.2 用单通道加样器取10uL灭活的被检血清加到微量板与血清编号相应的孔中，每份血清作4个孔。
4.2.2.3 病毒工作液稀释方法同4.2.1.4。
4.2.2.4 用多通道加样器将病毒工作液加到微量板的各孔中，每孔50uL。
4.2.2.5 以下操作按4.2.1.6～4.2.1.9规定进行。
4.2.3 双份血清测定
4.2.3.1 双份被检血清取自同一动物，间隔21d，按4.1.5采集、处理。
4.2.3.2 试验操作方法同4.2.1。
4.3 结果判定
试验后第4d开始观察结果，并于第6d作终判。
当细胞对照孔内细胞单层生长良好，病毒用量在50TCID50/50uL一500TCID50/50uL范围之内，阳性血清对照孔不出现细胞病变，阴性血清对照孔出现细胞病变，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，应重作。
4.3.1 判定标准
4.3.1.1 定量试验：
每份血清同一稀释度的4个孔中有两个孔完全被保护，不出现细胞病变(CPE)时，该稀释度倒数即为该血清的抗体滴度。
4.3.1.2 定性试验：
被检血清在1：5稀释时有2个或2个以上孔的细胞被完全保护，该血清即为阳性。
4.3.1.3 双份血清测定
当相隔21d的第二份血清的滴度高于第一份血清两个或两个以上滴度，则证明该动物正在发病过程中。
附 录 A
（标准的附录）
溶液的配制
A.1 pH7.0～7.6 0.01mol／L磷酸盐缓冲液(PBS)的配制
A.1.1 0.2mol／L磷酸缓冲液(PB)(母液)的配制见表A1。
表A1 各种pH0.2mol/LPB(母液)的配制比例表(100mL母液)
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pH |
0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)mL |
0.2mol／L磷酸二氢纳(NaH2 PO4)mL |
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7.0 |
61.0 |
39.0 |
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7.2 |
72.0 |
28.0 |
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7.4 |
81.0 |
19.0 |
|
7.6 |
87.0 |
13.0 |
按所需pH值查表A1，按体积比例混合二液，即为0．2mol／L母液。
A.1.2 0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制：将母液用蒸馏水作20倍稀释，并按0.85％加入氯化钠即得。
A.2 pH9.0—9.5 0.5mol/L碳酸盐缓冲甘油的配制
A.2.1 pH9.0～9.5 0.5mol/L碳酸盐缓冲液的配制见表A2。
表A2 pH9.0—9.5 0,5mol/L碳酸盐缓冲液 mL
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pH |
0.5mol/L碳酸氢钠(NaHCO3)mL |
0.5mol/L碳酸钠(Na2CO3)mL |
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9.0—9.5 |
3 |
1 |
按表A2所列体积混合二液即可。
A.2.2 pH9.0—9.5碳酸甘油的配制：碳酸盐缓冲液：甘油(中性)=1：9，混合即得。
附 录 B
（标准的附录）
细胞培养液的制备
B.1 汉克氏(Hanks)原液(10倍原液)
氯化钠(NaCl) 40.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 0.6g
氯化钾(KCl) 2.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.3g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.0g
葡萄糖 5.0g
氯化钙(CaCl2) 0.7g
双蒸馏水加至 500mL。
500mL加lmL三氯甲烷充分振荡，4℃冰箱保存。
Hanks液为Hanks原液稀释10倍。
Hanks液1000mL+4mL酚红，68.94kPa灭菌10min。
B.2 0.5％(乳汉液L—H液)
Hanks 1000mL
水解乳蛋白 5g
酚红 4mL
69kPa灭菌10min，4℃冰箱保存。
附 录 C 牛睾丸（或牛肾、鼻甲）原代细胞的制作
(标准的附录)
C.1 选择健康初生犊牛，放血致死，无菌取睾丸或肾脏、鼻甲组织。
C.2 将组织(牛肾剪取皮质部)，剪成lmm3～2mm3小块组织，用含300IU/mL双抗的汉克氏液(见附录B中B1)漂洗2—3次，并漂去漂浮的碎渣组织，倒去液体。
C.3 按组织重量的5倍，加人0.25％胰酶～Hahks液(pH7.4～7.8)，置37℃水浴中消化30min～40min。沉淀片刻，除去胰酶。
C.4 用汉克氏液洗2～3次后，加入适量营养液[含5％～10％犊牛血清的乳汉液(见附录B中B2)]吹打、分散已消化疏松的组织。用4层纱布滤过，制成约40万/ mL～70万/mL活细胞悬液备用。
也可分装于培养瓶，培养成单层，保存于4℃备用。 |