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猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。
本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。
本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、佟有恩。
1范围
本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。
本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。
2病毒分离与鉴定
2.1材料准备
2.1.1器材
倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。
2.1.2培养基及溶液的配制
磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)液(配制方法见附录A)。
2.1.3细胞
Vero细胞系。
2.2病毒分离
2.2.1病料采集
采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。
2.2.2病料处理
将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000 IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素、PBS液制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。
2.2.3接种及观察
将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Vero细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃吸附1h，根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d～4d，按致细胞病变作用(CPU变化情况，可盲传2代～3代。
2.3结果判定
CPE变化的特点是:细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞(7个～8个甚至几十个)，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落，这是特征性的CPE，可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。
3直接荧光抗体法
3.1材料准备
3.1.1器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。
3.1.2荧光抗体(FA)。
3.1.3溶液配制:磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油(配制方法见附录B)。
3.2操作方法
3.2.1标本片的制备
3.2.1.1组织标本
采急性期内(5d～7d)患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片(4μm～7μm)，丙酮中固定10min ，置PBS中浸泡10min～15min，风干或自然干燥。
3.2.1.2细胞培养盖玻片
将分离毒细胞培养24h～48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次，放入丙酮中固定10min ，再置于PBS中浸泡10min～15min，风干。
3.2.2 FA染色
3.2.2.1用0.02%伊文思蓝溶液将FA稀释至工作浓度(1:8以上合格)。
3.2.2.2 4000r/min离心10min，取上清液滴于标本上。
3.2.2.3 37℃恒温恒湿染色30 min ，用PBS冲洗3次，依次为3min、4min、5min，风干，滴加磷酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。
3.2.3结果判定
判定标准:在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰。并在阳性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。
可根据细胞内荧光亮度强、弱分别作如下记录:
a)++++:呈闪亮苹果绿色荧光；
b)+++:呈明亮苹果绿色荧光；
c)++:呈一般苹果绿色荧光；
d)+:呈较弱绿色荧光；
e)-:呈红色。
结果为a)～d)者均判为阳性。
4双抗体夹心ELISA
4.1材料准备
4.1.1器材:定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪。
4.1.2猪抗PED-IgG及猪抗PED-IgG-HRP(HRP为辣根过氧化物酶)。
4.1.3溶液配制:洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液〔配制方法见附录C〕。
4.1.4待检样品:发病仔猪粪便或肠内容物，用浓盐水1:5稀释，3000r/min离心20min，取上清液待检。
4.2操作方法
4.2.1冲洗包被板
向各孔注入无离子水，浸泡3min甩干，重复3次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。
4.2.2包被抗体
用包被稀释液稀释猪抗PED-IgG至使用倍数，每孔加100μL，置4℃过夜，弃液，用洗液冲洗3次；每次3min。
4.2.3加样品
将被检样品用样品稀释液(见第C.3章)做5倍稀释，加入两孔，每孔100μL，每块反应板设阴性抗原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置37℃作用2h，弃样品，冲洗同4.2.2。
4.2.4加酶标记抗体
每孔加100μL经酶标抗体稀释液稀释至使用浓度的猪抗PED-IgG-HRP，置37℃2h，弃液，冲洗同4.2.2。
4.2.5加底物溶液
每孔加新配制的底物溶液100μL，置37℃ 30min。
4.2.6终止反应
每孔加终止液50μL，置室温15min。
4.3结果判定
用酶标测试仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值。阳性抗原对照两孔平均OD值>0.8，阴性抗原对照两孔平均OD值≤0.2为正常反应，按以下两个条件判定结果: P/N值≥2，且被检抗原两孔平均OD值≥0.2判为阳性，否则为阴性。
注：P为阳性孔的OD值，N为阴性对照孔的OD值。
5血清中和试验
5.1材料准备
5.1.1器材:微量移液器及配套吸头，96孔微量平底反应板，二氧化碳培养箱或温箱，倒置显微镜，微量振荡器及小培养瓶等。
5.1.2细胞:Vero细胞系。
5.1.3病毒抗原和标准阴、阳性血清。
5.1.4指示毒毒价测定后立即小量分装，-33℃冻存，避免反复冻融，使用剂量为500TCID50～1000TCID50。
5.1.5样品:同头份的健康(或病初)血清和康复三周后的双份被检血清在同条件下测定，单份血清也可以进行检测。
5.1.6溶液配制抗体效价:稀释液、细胞培养液、病毒培养液、HEPES液。
5.2操作方法
5.2.1用稀释液倍比稀释血清，每份血清加4孔，每孔50μL，再分别加50μL指示毒。
5.2.2经微量振荡器振荡1min～2min ，置37℃中和1h。
5.2.3每孔加细胞悬液100μL (20万～30万个细胞/mL)，微量板置37℃二氧化碳培养箱或用胶带封口置37℃温箱培养，72h～96h判定结果。
5.2.4设阴、阳性对照，病毒对照和细胞对照，阴性血清与待检血清同倍稀释，阳性血清做2-6稀释。
5.3结果判定
当病毒抗原及阴性血清对照组均出现CPE，阳性血清及细胞对照组均无CPE时，试验成立。以能抑制50%以上细胞出现CPE的血清最高稀释度的倒数判定为该血清PED抗体效价的滴度。
血清中和抗体效价1:8以上为阳性反应；1:4为疑似反应；小于1:4为阴性反应，疑似血清复检一次，仍为可疑时，则判为阴性。
发病后三周以上的康复血清滴度是健康(或病初)血清滴度的4倍或以上判为阳性反应。
6间接ELESA
6.1材料准备
6.1.1仪器设备:定量加液器，微量移液器及配套吸头，96孔或40孔聚乙烯微量反应板，酶标测试仪等。
6.1.2抗原和酶标抗体。
6.1.3溶液配制:磷酸盐缓冲液，包被稀释液，样品稀释液，酶标抗体稀释液，底物溶液及终止液。
6.2操作方法
6.2.1冲洗包被板
向各孔注入无离子水，浸泡3min，甩干，重复3次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。
6.2.2抗原包被
用包被稀释液稀释抗原至使用浓度，包被量为每孔100μL，置4℃冰箱湿盒内过夜，弃掉包被液，用洗液冲洗3次，每次3min。
6.2.3加被检及对照血清
将每份被检血清样品用血清稀释液做1:100稀释，加入两个孔，每孔100μL 。每块反应板设阳性、阴性血清及稀释液对照各两孔，每孔100μL盖好包被板置37℃湿盒内1h，冲洗同6.2.2.
6.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至使用浓度，每孔加100μL，置37℃湿盒内1h，冲洗同6.2.2。
6.2.5加底物溶液
每孔加新配制的底物溶液100μL在室温下避光反应5min～10min。
6.2.6终止反应
每孔加终止剂50μL 。
6.3结果判定
6.3.1目测法
阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色，阴性对照血清孔无色或基本无色，被检血清孔凡显色者即判抗体阳性。
6.3.2比色法
用酶标测试仪，在波长492nm下，测定各孔OD值，阳性对照血清的两孔平均OD值>0.6，阴性对照血清的两孔平均OD值＞0.162为正常反应，OD值≥0.200为阳性；FOD值0.200～0.400时判为"+"；0.400～0.800判为"++"；OD值>0.800判为"+++"；OD值在0.163～0.200之间为疑似；OD值<0.163为"-"，对疑似样品可复检一次，复检结果如仍为疑似范围，则看P/N比值，P/N比值≥2判为阳性，P/N比值<2者判为阴性。
附录A
(规范性附录)
溶液的配制
A.1 0.02mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制
A.1.1 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.64g，先加适量无离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。
A.1.2 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.21g，先加适量无离子水溶解，最后定容至1000 mL，混匀。
A.1.3量取0.2mL/L磷酸氢二钠溶液360 mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL，称取氯化钠38g，用无离子水溶解稀释至5000mL，4℃保存。
A.2细胞培养液的配制
含10%灭活犊牛血清的1640营养液，加100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素，用5.6%碳酸氢纳(NaHCO3)调pH值至7.2，如需换液则血清含量为5%。
A.3病毒培养液的配制
1640培养液中加下列成分使最终浓度各达到:
1%二甲基亚枫(DMSO)
5μg /mL～10μg /mL胰酶；
100 IU/mL青霉素；
100μg/mL链霉素；
以5.6%碳酸氢钠(NaHCO3)调pH至7.2。
A.4 HEPES液的配制
称取0.2385g HEPES溶于100mL无离子水中，用1mol/L氢氧化钠(NaOH)调整pH至7.0～7.2，过滤后置4℃备用。
附录B
(规范性附录)
直接荧光抗体法溶液的配制
B.1 0.1%伊文斯蓝原液的配制
称取伊文斯蓝0.1g溶于100mL 0.02mol/L pH7.2PBS中，4℃保存，使用时稀释成0.02%浓度。
B.2磷酸盐缓冲甘油的配制
量取丙三醇90mL，0.02mol/L pH7.2 PBS 10 mL，振荡混合均匀即成，4℃保存。
附录C
(规范性附录)
双抗体夹心ELISA溶液的配制
C.1洗液的配制
量取50μL吐温-20，加入100mL 0.02mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(见第A.1章)中。
C.2包被稀释液的配制
C.2.1 0.1mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液:
0.lmol/L碳酸钠液:称取碳酸钠10.6g，加无离子水至1000mL。
0.1mol/L碳酸氢钠液:称取碳酸氢钠8.4g，加无离子水至1000mL。
C.2.2量取0.1mol/L碳酸钠液200mL，0.1mol/L碳酸氢钠液700mL，混合即成。
C.3样品稀释液的配制
加0.05%吐温-20，1%明胶的0.02mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液。
C.4酶标抗体稀释液的配制
加0.05%吐温-20，1%明胶及5%灭活犊牛血清的0.02mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液。
C.5底物溶液的配制
PH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液(内含0.04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)。
PH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液:称取柠檬酸21.01g ，加无离子水至1000mL，量取243mL与0.2mol/L磷酸氢二钠液(见A.1.1)257mL混合，于4℃冰箱中保存不超过一周。
称取40mg邻苯二胺，溶于100mL pH5.O磷酸盐柠檬酸缓冲液中(用前从4℃冰箱中取出，在室温下放置20min～30min〉，待溶解后，加入150μL过氧化氢，根据试验需要量可按此比例增减。
C.6终止液的配制 2mol/L硫酸，并取浓硫酸4mL加入32mL无离子水中混匀。 |