|
鸡传染性喉气管炎是鸡的重要疫病之一，世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]将本病定为B类动物疾病，我国定为二类动物疫病。
本标准主要参照OIE推荐的鸡传染性喉气管炎(ILT)诊断方法制定。
本标准的附录A、附录B为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:农业部动物检疫所。
本标准主要起草人:范根成、王永玲、刘相娥、王红。
1范围
本标准规定了鸡传染性喉气管炎病毒分离及琼脂凝胶免疫扩散试验的技术要求。
本标准规定的病毒分离技术，适用于本病的确诊。琼脂凝胶免疫扩散试验，适用于传染性喉气管炎的血清学诊断及用传染性喉气管炎疫苗免疫后的抗体检测。
2病毒分离鉴定技术
2.1材料准备
2.1.1病料的准备
2.1.1.1活体采样:用灭菌棉拭子伸入口咽或气管采集分泌物，放入含青霉素4000 IU/mL，链霉素4000 μg//mL的无菌生理盐水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，处理方法同上。
2.1.1.2尸体采样:无菌采取病死鸡喉头和气管，放入无菌的平皿或烧杯中，密封。
2.1.2样品的运送。
采集的样品应立即放入4℃冰箱保存，24h内送到实验室；不能在24h内送到实验室时，应将所采样品冷冻保存和运输。2.1.3样品处理
2.1.3.1收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动、挤干棉拭子，将样品液经10000 r/min离心10min，取上清液，加入青霉素4000 IU/mL、链霉素4000 μg//mL，于37℃作用30min，作为接种材料。
2.1.3.2组织样品:无菌条件下将组织剪碎，按1:4加入生理盐水后用研磨器研磨制成20%的匀浆悬浮液，再经10000 r/min离心10 min ，取上清液，加入青霉素4000 IU/mL，链霉素4000μg//mL，于37℃作用30min ，作为接种材料。
2.2操作方法
2.2.1样品接种
取经处理过的样品，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜。每枚0.2mL，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d ，弃去24h内死亡的鸡胚，24h～120h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成；120 h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。有痘斑者，取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨后，置－20℃冻存备用；无痘斑者，亦取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨，反复冻融，离心后，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜盲传。如此盲传3代以上，如仍无病变，则判为鸡传染性喉气管炎阴性。
2.2.2病毒鉴定
病毒分离物的鉴定:用鸡传染性喉气管炎标准阳性血清(效价在1:32以上)和标准阴性血清与分离物作鸡胚中和试验，固定血清，稀释病毒法中和试验操作方法。
血清处理:将传染性喉气管炎标准阳性血清和标准阴性血清56℃灭活处理30min。
病毒稀释:将病毒分离物用含青霉素1000 IU/mL、链霉素1000 μg/mL的灭菌生理盐水稀释，稀释方法见表1。
表1病毒分离稀释方法
|
管号 |
病毒分离物稀释度 |
试管中的混合液 |
|
1 |
2×10-1 |
1mL病毒分离物愿液+4mL稀释液 |
|
2 |
2×10-2 |
1mL2号管液+9mL稀释液 |
|
3 |
2×10-3 |
1mL3号管液+9mL稀释液 |
|
4 |
2×10-4 |
1mL4号管液+9mL稀释液 |
|
5 |
2×10-5 |
1mL5号管液+9mL稀释液 |
病毒-血清混合液:设两排试验管，每排4个管，第1排每管放0.6mL标准阳性血清，第2排每管放0.6mL阴性血清，然后向每排1～4号试验管内分别加入(2×10-2～2×10-5)稀释的病毒悬液各0.6mL，将病毒-血清悬液混合并置冰箱(4℃～8℃)4h。
鸡胚接种及结果判定:取经处理过的病毒-血清混合液，分别接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜，0.2mL/枚，每管接种5枚，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d，弃去24h内死亡的鸡胚，24h～120h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成；120h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。记录观察结果，按半数致死量(Reed—Muench)方法计算EID50，计算方法见附录A(规范性附录)。
2.3结果判定
如分离物能引起鸡胚绒毛尿囊膜出现典型的痘斑，并且经鸡胚中和试验，其阴性血清组和阳性血清组的EID50的对数之差大于或等于2.5时，则判定分离物为鸡传染性喉气管炎病毒。
3琼脂凝胶免疫扩散试验
3.1材料准备
3.1.1器材:烧杯，直径85mm培养皿，孔径4mm的打孔器，6～9号针头，微量移液器及针头。
3.1.2琼脂扩散抗原。
3.1.3标准阳性血清。
3.1.4被检血清:无菌采血，分离血清，4℃或-20℃保存备用。
3.1.5琼脂平板:配制方法见附录B(规范性附录)。
3.2操作方法
3.2.1琼脂板打孔
在琼脂糖平皿上，按坐标纸上画好的梅花型(见图1)打孔，孔径4mm，孔间距3mm。挑出孔内琼脂，在火焰上封底。
① ②
⑥ ⑦ ③
⑤ ④
图1 打孔样式
3.2.2加样
用微量移液器加样，中央孔(7孔)加抗原，1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔加待检血清，每孔均以加满不溢出为度。
3.2.3反应
加样完毕后，静置10min ，放入37℃带盖的湿盒中反应，分别在12h、24h、36h观察并记录结果。
3.3结果判定
3.3.1判定方法
将琼脂板置暗背景或强光照射下观察。标准阳性血清孔与抗原孔之间出现一条清晰的沉淀线，则试验成立；若无沉淀线或沉淀线不明显，则试验不成立，应重做。
3.3.2判定标准
3.3.2.1被检样品孔与中央孔之间形成清晰的沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相融合者，为阳性。
3.3.2.2被检血清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，但标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端向被检血清孔的内侧弯曲看，为弱阳性。
3.3.2.3被检血清孔与抗原之间无沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线直伸向被检血清孔的边沿无弯曲者，判为阴性。
3.3.2.4有的被检血清与抗原之间可能出现两条以上沉淀线，其中一条与标准阳性血清-抗原间沉淀线融合者判为阳性；均不融合者为阴性，此沉淀线为非特异性沉淀线。
附录A
(规范性附录)
鸡胚半数感染量(EID50)测定方法(Reed-Muench法)
B.1定义
鸡胚半数感染量(EID50)指能使50%鸡胚感染的病毒量，常用Reed-Muench法计算。
B.2计算公式
按式(A.1)、式(A.2)计算:
lg EID50=高于50%死亡率的病毒稀释度的对数+距离比例值×稀释倍数的对数……………(A.1)
距离比例值=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%的死亡率) ……………(A.2)
B.3举例
病毒毒价测定(接种数量0.1mL/枚)见表A.1。
表A.1
|
接种病毒稀释 |
鸡胚 |
累计数 |
死亡数/总数比例 |
死亡百分数/% |
|
死亡数 |
健活数 |
死 |
活 |
|
10-4 |
5 |
0 |
12 |
0 |
12/12 |
100 |
|
10-5 |
4 |
1 |
7 |
1 |
7/8 |
88 |
|
10-6 |
2 |
3 |
3 |
4 |
3/7 |
43 |
|
10-7 |
1 |
4 |
1 |
8 |
1/9 |
11 |
表中第1列为接种的稀释度，第2列为死亡鸡胚数，第3列为活鸡胚数，后面的两列分别是第2列和第3列的累计数。
距离比值=(88%-50%)/(88%-43%)=38/45=0.84
lg EID50=-5+0.84×(-1)=-5.84
EID50=10-5.84/0.1mL
附录B
(规范性附录)
琼脂平板制备方法
用含8%氯化钠的蒸馏水加万分之一叠氮化钠配制成1%琼脂糖，103kPa高压蒸汽灭菌或水浴加热使琼脂充分溶化，加入直径为85mm的培养皿中，每皿16mL，平置，室温下凝固后，置4℃备用。 |