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1 范围
本标准规定了绵羊痘和山羊痘诊断技术要求。
本标准所规定的临床检查适用于产地、市场、口岸等羊痘的现场检疫。细胞中和试验适用于羊痘的检疫和流行病学调查。电镜检查、包涵体检查适用于羊痘的诊断和病原鉴定。
2 临床检查
2.1 临床特征
绵羊痘和山羊痘的潜伏期一般为7d一14d。感染初期表现为发热，精神、食欲渐差。经2d―3d，当体温升至40℃以上时，即先在体表无毛或少毛部皮肤及可视黏膜上出现痘疹，随后在全身出现散在或密集的痘疹，进而形成痘肿，分典型痘肿和非典型痘肿。
典型(全经过型)痘肿：初起时，痘肿呈圆型皮肤隆起，皮肤呈微红色，边缘整齐，进而发展为皮下湿润、水肿、水泡、化脓、结痂等系列反应。同时，痘肿的质地由软变硬；皮肤颜色也由微红色逐渐变为深红、紫红，严重的可成为“血痘”。患羊一般为全身发痘，并伴有全身性反应。
非典型(不全经过型)痘肿：痘肿在发生、发展，直至消退的全过程中，皮肤无明显红色，无严重水肿，以及出现水泡、化脓、结痂等系列反应，痘肿较小，质地较硬及至有的成为“石痘”。患羊无严重的全身性反应。
有的病羊随着病程的发展，尚可见鼻炎、眼结膜炎、失明、浅表淋巴结肿大、喜卧不起、废食、呼吸困难、肺炎和继发感染等症状。严重的体温急剧下降，随后死亡。
存活病羊，可在痘肿结痂后约1—2个月，因痂皮自然脱落，而在皮肤上留下痘痕(疤)。
2.2 病理变化
病羊痘肿皮肤的主要病理变化，表现为一系列的炎性反应。包括细胞浸润、水肿、坏死和形成毛细血管血栓等。尸体剖检，通常可见不同程度的黏膜坏死、全身淋巴结肿大，呼吸和消化器官上有大小、多少不等的痘斑、结痂或溃疡。特别是在肺脏，尤为明显。在肝、肾表面，偶能见到白斑。
2.3 判定
根据2.1临床检查结果可作出初步判定。
在皮肤或可视黏膜上有明显呈散在或密集痘疹、痘肿或病理变化明显的判为病羊。
精神、食欲、体态有异常；皮肤或可视黏膜上有疑似痘疹、痘痕(疤)的判为可疑羊。可疑羊应继续观察或做血清学试验以及电镜检查或包涵体检查。
3 中和试验
3.1 细胞中和试验
3.1.1 材料准备
3.1.1.1 细胞培养用营养液及溶液，配制方法见附录A。
3.1.1.2 绵羊羔睾丸细胞(ST)制备方法见附录B。
3.1.1.3 绵羊痘和山羊痘抗原及相应标准血清。
3.1.1.4 待检羊血清：以无菌手术自学的颈静脉采血，并按常规方法分离血清。经56℃30min灭能后使用。
3.1.1.5 待检羊组织抗原：以无菌手术剪取疑似痘肿皮肤或痂皮，用汉克(Hanks)液(见第A.1章)浸泡(含抗生素)30min、冲洗等处理后称量，用Hanks液制成1：10悬液，以1500r/min离心10min，吸上清备用。
3.1.2 操作方法一(检血清抗体)
3.1.2.1 抗原稀释
按瓶签注明装量，用Hanks液(见第A．1章)作1：100稀释。
3.1.2.2 加样
每份被检血清取试管二支，各加血清0.5mL。然后，一管加入等量抗原稀释液(中和试验用)；另一管则加入等量汉克(Hanks)液(血清毒性试验用)。
另取试管一支加汉克(Hanks)液0.5mL，然后加入等量抗原稀释液(抗原对照用)。
3.1.2.3 中和
将各试管混合物摇匀后置37℃水浴中和1h，期间每15min振摇一次。
3.1.2.4 接种
取每管混合物接种绵羊睾丸(ST)细胞单层两瓶。接种量为该细胞生长液的10％。接种时，倾去细胞生长液。接种后先置37℃温箱吸附30min(期间轻轻摇动两次)，然后补足细胞维持液乳汉液(见第A．6章)，乳汉液内含3％一5%犊(胎)牛血清，1％抗生素溶液，调pH(7.4)，放37℃温箱培养。同时，设正常对照细胞两瓶。
3.1.2.5 观察
培养4d―6d，每天用显微镜观察致细胞病变作用(CPE)，其特征是细胞出现间隙，形成圆细胞和聚积成簇，胞浆内颗粒增多，显示出退行性变化，失去正常形态，最终呈网状并脱落。
3.1.2.6 结果判定
当正常对照细胞和接种血清毒性试验细胞无CPE，而接种抗原对照细胞有明显CPE，试验方可成立，否则应重做。
血清中和后，接种细胞有CPE，判该羊未感染羊痘。
血清中和后，接种细胞无CPE，判该羊已感染羊痘。
3.1.3 操作方法二(检抗原)
3.1.3.1 稀释
抗原稀释按3.1.2.1。
阳性血清稀释：按瓶签注明装量，用汉克(Hanks)液做1：2稀释。
3.1.3.2 加样
每份待检抗原取试管两支，分别加入抗原悬液0．5mL。然后，向其中一管加入等量阳性稀释血清，向另一管加入等量汉克(Hanks)液(待检抗原对照)。
另取试管两支，一支加羊痘稀释抗原0.5mL，另一支加阳性稀释血清0.5mL，然后分别加人等量汉克(Hanks)液(羊痘抗原对照，阳性血清对照)。
3.1.3.3 中和
见3.1.2.3。
3.1.3.4 接种
见3.1.2.4。
3.1.3.5 观察
见3.1.2.5。
3.1.3.6 结果判定
当正常对照细胞和阳性血清对照细胞无CPE，而接种羊痘抗原的细胞有CPE，试验方成立，否则应重做。
待检抗原中和后，接种细胞无CPE，而未中和待检抗原的接种细胞有与接种羊痘抗原细胞相同的CPE，判该待检抗原为羊痘抗原。
待检抗原中和，接种细胞均有CPE，待检抗原未中和的，接种细胞均无CPE，均判该待检抗原为非羊痘抗原。
4 电子显微镜检查
4.1.1 材料准备
待检组织悬液(见3.1.1.5)。
4.1.2 载玻片，应洁净。
4.1.3 取400目电镜甲碳网膜，以戊按蒸气通过辉光放电激活。
4.2 操作方法
取一滴组织悬液置于载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴上lmin，再置于一滴三羟甲基氨基甲烷—乙二胺四乙酸(Tris—EDTA)缓冲浪中浸泡20s，然后用一滴1％的磷钨酸(pH7.2)染色10s。取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。
4.3 判定
羊痘病毒颗粒应呈砖形，其表面有短管状物覆盖，大小约290nm×270nm。有些病毒粒子周围有寄主细胞膜包裹。
5 包涵体检查5材料准备病
料：取活体或剖检羊的痘肿皮肤，或肺和淋巴结等其他组织材料(该材料应带有病变组织周围的正常组织)，置福尔马林溶液中或4℃保存备用。
4.3.2.1 载玻片：应洁净。
4.3.2.2 苏木精伊红(H—E)染色液：按常规配制。
4.3.3 操作
取病料组织，用切片机切成薄片置载玻片上，或直接将病料在载玻片上制成压片(触片)。用H-E染色和福尔马林固定后，置光学显微镜检查。
4.3.4 判定
羊痘病料寄主细胞质内应有不定形的噬酸性包涵体和有空泡的细胞核。
附 录 A规范性附录）
营养液及溶液的配制
A.1 汉克液(Hanks)(10倍浓缩液)
A.1.1 成分
A.1.1.1 成分甲
氯化钠 80.0g
氯化钾 4.0g
氯化钙 1.4g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 2.0g
A.1.1.2 成分乙
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 1.52g
磷酸二氢钾 0.6g
葡萄糖 10.0g
1％酚红 16mL
A.1.2 配制方法
按顺序将上述成分分别溶于双蒸水450mL中，即配成甲液和乙液，然后将乙液缓缓加入甲液，边加边搅拌。补足双蒸水至1000mL，用滤纸过滤后，加入三氯甲烷0.2UM同，置2℃—8℃保存。
A.1.3 使用
使用时，用双蒸水稀释10倍，107.6kPa灭菌15min，置普通冰箱备用。用前以7.5%碳酸氢钠溶液调pH为7.2—7.4。
A.2 7.5%碳酸氢纳溶液
碳酸氢钠 7.5g
双蒸水 100.0mL
用微孔或蔡氏滤器滤过除菌，分装于小瓶中，结冻保存。
A.3 1%酚红溶液
A.3.1 氢氧化钠(1mol/L)的制备：取澄清的氢氧化钠饱和液56mL加新沸过的冷双蒸水使成1000mL即得。
A.3.2 称酚红10g加氢氧化钠溶液20mL搅拌，溶解并静置片刻，将已溶解的酚红液倒人1000mL刻度容器内。
A.3.3 未溶解的酚红再加氢氧化钠溶液20mL搅拌，使其溶解。如仍未完全溶解，可再加少量氢氧化钠溶液搅拌。如此反复，直至酚红完全溶解为止，但所有氢氧化钠溶液总量不得超过60mL。
A.3.4 补足双蒸水至1000mL，分装小瓶，107.6kPa灭菌15min后，置2℃―8℃保存备用。
A.4 0.25％胰蛋白酶溶液
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
柠檬酸钠(Na3C6H5O7·5H2O) 1.12g
磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 0.056g
碳酸氢钠 1.0g
葡萄糖 1.0g
胰蛋白酶(1：250) 2.5g
双蒸水 加至1000mL
放2℃—8℃冰箱过夜，待胰酶充分溶解后，用0.2uL的微孔膜或G6型玻璃滤器滤过除菌。分装于小瓶中，-20℃保存。
使用时，用碳酸氢纳溶液调pH为7.4—7.6。
A.5 EDTA—胰蛋白酶分散液(10倍浓缩液)
A.5.1 成分
氯化钠 80.0g
氯化钾 4.08
葡萄糖 10.0g
碳酸氢钠 5.8g
胰蛋白酶(1：250) 5.0g
乙二胺四乙酸二钠(EDTAA·R) 2.0g
按顺序溶于双蒸水900mL中，然后加入下列各液：
1％酚红溶液 2.0mL
青霉素(10万IU/mL) 10.0mL
链霉素(10万/ug/mL) 10.0mL
补足双蒸水至 1000mL
A.5.2 用0.2um微孔滤膜或G6型玻璃滤器滤过除菌，分装小瓶，-20℃保存。
A.5.3 临用前，用双蒸水稀释10倍，适量分装于试管中，-20℃冻存备用。
A.5.4 分散细胞时，将细胞分散液取出融化后，再置35℃一37℃热水中预热，并用7.5%碳酸氢纳调pH为7.6—8.0。
A.6 5%乳汉液
水解乳蛋白 5.0g
汉克氏液(Hank’s) 1000.0mL
完全溶解后适量分装，经107.6kPa灭菌15min，放2℃―8℃保存备用。
用时，以7.5%碳酸氢钠溶液调pH为7.2～7.4。
A.7 抗生素溶液(1万单位／mL．,)
A.7.1 10倍浓缩液
青霉素 400万IU(80万单位/瓶×5瓶)
链霉素 400万ug(100万单位/瓶×4瓶)
双蒸水 40mL
充分溶解混合后，分装小瓶，放-20℃保存。
A.7.2 工作溶液
取上述浓缩液适量，用双蒸水稀释10倍，分装后放-20℃保存备用。
附 录 B
（规范性附录）
绵羊羔睾丸细胞的制备
B.1 原代细胞制备
选用4月龄以内的健康雄性绵羊，以无菌手术摘取睾丸，剥弃鞘膜及白膜，剪成lmm―2mm小块，用汉克氏液(见第A.1章)洗3―4次，按睾丸组织量的6―8倍加入0.25％胰酶溶液(见第A.4章)，置37℃水浴中消化，至睾丸组织是膨松状，弃胰酶液，用玻璃珠振摇法或吸管吹打法分散细胞并用细胞生长液[乳汉液(见第A.6章加5％一10％胎(犊)牛血清+1％抗生素溶液]稀释成每毫升含100万左右细胞数，分装，放37℃静置培养，2d一4d即可长成单层。
B.2 次代细胞制备
将生长良好的原代细胞，倒去生长液加入原生长液量十分之一的EDTA—胰蛋白酶分散液(见第A.5章)，消化2min―3min，待细胞层呈雪花状时，倒去EDTA液。先用少许生长液摇下细胞，然后按1：2的分种率，补足生长液。混匀、分装，置37℃静置培养。细胞传代，应不超过5代。 |