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禽曲霉菌病是多种禽类、哺乳动物和人畜共患的一种真菌病。主要侵害呼吸系统，在肺和气囊发生炎症和小结节，导致呼吸困难，甚至窒息死亡。病原体主要为曲霉属中的烟曲霉和黄曲霉，其次为构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉等。本病发生于世界各地，对雏鸡的危害最大，可引起幼雏大批死亡，造成重大经济损失。
对曲霉菌病的诊断，近年来提出了一些新技术。但是，各国确定的常用方法，仍是本标准规定的病理学检查和病原学检查。病理学检查(包括在病变组织内发现曲霉菌)可以确定病性，病原学检查不仅可以提高诊断率，而且能够鉴定曲霉菌菌种。
国际上无相应的诊断标准或规范可供参照。本标准的实施，对提高我国禽曲霉菌病的诊断水平，保证养禽业健康发展，将起到重要的作用。
本标准的附录A、附录B为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国人民解放军军需大学。
本标准主要起草人:宣华、向华。
1范围
本标准规定了禽曲霉菌病病理学和病原学检查的技术要求。
本标准适用于禽(鸟)类曲霉菌病的诊断和检疫。
2病理学检查
2.1材料准备
2.1.1器材
小动物解剖器具，灭菌试管(供采集真菌学检查样品用)，普通显微镜等。
2.1.2试剂
体积分数为10%的甲醛溶液，30%甘油缓冲溶液，其配方见附录A。
2.2尸体剖检方法
按照常规的禽类尸体剖检术式，将可疑病禽的各内脏器官取出，逐一检查。重点检查呼吸系统。如发现可疑病变，先取1份置于无菌中试管内或30%甘油缓冲溶液(见第A.1章)中，供病原学检查用，再取1份置入10%甲醛溶液内，供病理组织学检查用。
2.3主要病理变化
禽曲霉菌病的病变主要见于呼吸系统，在肺脏和气囊形成数量不等、粟粒大至绿豆粒大的结节，结节质地较硬，切面呈同心圆轮层状。显微镜检查，见结节周边为淋巴细胞、多核巨细胞和成纤维细胞构成的肉芽组织，中央为干酪样坏死区，内含大量的霉菌菌丝。可在气囊、气管、支气管、肺脏及腹膜表面形成大小不一的霉菌斑，菌斑上有灰绿色粒状物或绒球状物。此外，有时在眼睑内、肝、脾、肾、消化系统乃至神经系统表面也能发现类似的结节或菌斑病变。
3病原学检查
3.1材料准备
3.1.1器材
载玻片，盖玻片，培养皿，铂金耳或针，恒温箱，手术刀，普通显微镜等。
3.1.2试剂
20%氢氧化钾溶液，乳酸酚棉蓝染色液，沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基或改良察贝克(Czapek)氏琼脂培养基等，其配制方法见附录A。
3.1.3样品采集
对病理学检查可疑的病禽，应无菌操作采取带有病变(如结节、霉菌斑等)的组织各数小块，置于灭菌容器(如中试管)内冷藏，并尽快送检，如果不能立即送检，可暂时保存于30%甘油缓冲液中。
3.2检查方法
3.2.1压滴标本法
取结节置于载玻片上，用手术刀切开，由切面刮取干酪样坏死组织，或由病变组织表面刮取霉菌斑，或用铂金针钩取纯培养物置于载玻片中央，加1～2滴乳酸酚棉蓝染色液或生理盐水，用大头针将组织块或菌团撕扯开，压上盖玻片(注意勿产生气泡)，制成压滴标本。如果组织碎块较硬，可改用1～2滴20%氢氧化钾(KOH)溶液，并在火焰上微微加温后压片。显微镜检查时，先用低倍物镜发现目标，再用高倍物镜详细观察菌体形态。经棉蓝(见第A.2章)染色的菌体呈蓝色。
3.2.2分离培养法
取沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基(见第A.3章)或改良察贝克氏琼脂(见第A.4章)培养皿若干个(通常每份样品用4个)，做好标记。将铂金耳在火焰上烧灼灭菌，冷却后钩取干酪样坏死组织或霉菌斑，均匀涂抹于培养基表面；或者用铂金针蘸取样品，小块点播刺种于培养基表层。接种完毕，将铂金耳或针在火焰上烧灼灭菌，将接种过的培养皿放在27℃或37℃恒温箱内进行培养。通常于36h后即可见菌落出现。菌落形态见附录B(B.2.1.l ，B.2.2.1，B.2.3.1，B.2.4.l和B.2.5.1)。
4结果判定
在可疑病禽(鸟)的病变组织中，观察到或分离出曲霉菌，即可确诊为禽曲霉菌病。如要确定为何种曲霉菌所感染，则需参照附录B，依据菌落和菌体的形态特征，对所分离的曲霉菌进行菌种鉴定。
附录A
(规范性附录)
主要试剂的配制方法
A.1质量浓度为30%的甘油缓冲液
甘油(化学纯) 30.0mL
氯化纳(NaCl) 0.5g
磷酸氢二钠 1.0g
蒸馏水 加至100.0mL
先用少量蒸馏水溶解氯化钠和磷酸氢二钠，再加入甘泊，最后用蒸馏水补足量，混合，分装，于103.6kPa灭菌15min～20min后保存备用。
A.2乳酸酚棉蓝染色液
结晶石炭酸 20.00g
乳酸 20.00mL
甘油 40.00mL
棉蓝 0.05g
蒸馏水 20.00mL
将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入结晶石炭酸、乳酸、甘泊，混匀，备用。
A.3沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖 40 g
蛋白胨 10 g
琼脂粉 18g～20g
蒸馏水 1000mL
将以上成分倒入烧杯或三角烧瓶内，先加少量蒸馏水加热溶解。待完全溶解后补足蒸镏水至所需要的总体积，并加入氯霉素50?g/mL～100μg/mL，用四层纱布过滤，按要求定量分装于小烧瓶或中试管内，塞以棉塞，再于棉塞外加包牛皮纸和油纸各一层，挂上标签，于103.6kPa灭菌10min～15min后保存备用。
A.4改良察贝克(Czapek)氏琼脂培养基
蔗糖 30.00g
硝酸纳 3.00g
磷酸二氢钾 1.00 g
硫酸镁 0.50g
氯化钾 0.50g
硫酸亚铁 0.0lg
氯化钠 60.00g
琼脂粉 18g～20.00g
蒸馏水 1000.00mL
配制法同A.3。
附录B
(规范性附录)
禽曲霉菌病有关的曲霉菌的鉴别要点
B.1概述
引起禽曲霉菌病的病原体主要为烟曲霉和黄曲霉，其次为构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉等，这些曲霉菌都具有如下共同的形态结构:
a)菌丝:有隔，细胞多核；
b)分生孢子梗:由特化的膨大而厚壁的菌丝细胞(即足细胞)的中部向上又生而成；
c)顶囊: 分生孢子梗顶端的膨大部分，呈球形、椭球形、烧瓶形或棍棒形；
d)小梗:被覆于顶囊周边，一层或两层。如为两层，则内层叫梗基，外层叫瓶梗；
e)分生孢子:成串排列于小梗的游离端。
但是，不同的菌种在这些结构的形态上又有明显的不同。根据这些不同点，特别是分生抱子头(顶囊、小梗、分生孢子三部分的合称)的特征，结合菌落的形态和颜色，可将这几种曲霉菌区别开。禽曲霉菌病中常见曲霉菌形态见图B.1。
B.2鉴别要点
B.2.1烟曲霉
B.2.1.1菌落形态
烟曲霉在沙保劳氏葡萄糖琼脂培养基上生长良好，发育很快。开始菌落呈白色绒毛样或棉花丝样，3d～4d内，菌落中心变为烟绿色或深绿色，表面微细粉末状或绒毛样(形成大量分生孢子之故)。菌落背面无色或略带黄褐色。
在察贝克氏培养基上，生长旺盛，菌落呈绒毛状，气生菌丝直立而丰富，分生孢子头初呈白色或微带蓝色，有呈绿色者，继而转变为黑褐色。菌落背面无色或呈黄色，老菌落则可呈暗红色。
B.2.1.2菌体形态
参见图B.1中A。
a)分生孢子梗:光滑，较短(300μm～500μm)，宽5μm～8μm，常带绿色；
b)顶囊:烧瓶形，直径20μm～30μm，绿色；
c)小梗:生于顶囊上部，单层，梗长6μm～8μm，梗粗2.5μm～3.0μm，排列紧密；
d)分生孢子:球形或近球形，直径2.5μm～3.0μm，表面粗糙有细刺，带绿色；
e)菌核:不产生。
B.2.2黄曲霉
B.2.2.1菌落形态
菌落生长迅速，至10d～14d时，直径可达3cm～7cm。初似黄色粉末，继而密集隆起，变为黄绿色，日久则成棕绿色。表面平坦或有放射状沟纹。菌落背面无色或带褐色。
B.2.2.2菌体形态
参见图B.1中B
a)分生孢子梗:长约400μm～1000μm，宽约10μm～20μm，微弯曲，梗壁极粗糙，近顶囊处略膨大，无色；
b)顶囊:烧瓶形、球形或近球形，直径约10μm～65μm，但多数在25μm～45μm间；
c)小梗:单层、双层或单层双层并存于一个顶囊上，但以双层者居多。梗基长约7μm～10μm，宽约4.0μm～5.5μm，布满顶囊表面。瓶梗长约6.5μm～10.0μm，宽约3μm～5μm；
d)分生孢子:球形、近球形或梨形，直径约3.5μm～6.0μm，表面粗糙;
e)菌核:有些菌系产生褐色菌核。
B.2.3构巢曲霉
B.2.3.1菌落形态
在察贝克氏琼脂培养基上于27℃下培养，菌落生长快速，至14d时直径达5cm～6cm。最初为光滑绒毛状，亮绿色，平铺生长，继而变为暗绿色，中心呈粉末状，边缘有绒毛状菌丝。菌落背面深红色至紫红色。当闭囊壳形成时，菌落中心向外长出一些小白点，菌落呈黄褐色。
B.2.3.2菌体形态
参见图B.1中C。
a)分生孢子梗:极短(长约75μm～100μm，宽约3.5μm～5.0μm)，常有波状弯曲，近顶囊处稍膨大，壁光滑，带褐色或肉桂褐色；
b)顶囊:半球形，直径8μm～10μm；
c)小梗:双层，梗基短(长约5μm～6μm，宽约2μm)，分布于顶囊的顶部，呈放射状排列；瓶梗长约5μm～6μm，宽约2.0μm～2.5μm；
d)分生孢子:球形，直径3.0μm～3.5μm，表面粗糙有小刺，绿色；
e)闭囊壳:为该菌有性阶段的产物，球形，直径约135μm～150μm，略呈紫红色，内含子囊孢子。成熟的闭囊壳被淡黄色的壳细胞所包围。
B.2.4黑曲霉
B.2.4.1菌落形态
在察贝克氏琼脂培养基上于25℃下培养，菌落扩展迅速，至10d～14d直径可达2.5cm～3.0cm。初期有丰富的白色羊毛状气生菌丝，并常出现鲜黄色区域，继而变成粗绒状，黑色、黑褐色。菌落背面无色，或仅中心部分略带黄褐色。
B.2.4.2菌体形态
参见图B.1中D。
a)分生孢子梗:长约200μm～400μm，也有长达1000μm以上者，宽约10μm～20μm，壁厚、光滑，无色或梗的上部稍带黄色；
b)顶囊:球形或近球形，直径45μm～75μm，无色或带黄褐色;
c)小梗:双层，紧密排列于整个顶囊表面，呈放射状，褐色。梗基约400～500个，每个梗基长约20μm～30μm，宽约5μm～6μm，有时更宽并具有横隔；瓶梗较短，长约7μm～10μm，宽约3.0μm～3.5μm；
d)分生孢子:球形，直径4μm～5μm，褐色，表面极为粗糙;
e)菌核:有些菌系产生菌核，从不定形到圆形，直径约1000μm。
B.2.5土曲霉
B.2.5.1菌落形态
在察贝克氏琼脂培养基上生长较快，至10d时菌落直径达3.5cm～5.0cm。呈圆形，初平坦，或有放射状皱纹，渐而表面呈绒状，偶呈絮状，肉桂色或沙褐色。菌落背面培养基黄色或污褐色。
B.2.5.2菌体形态
参见图B.1中E。
a)分生孢子梗:长约100μm～250μm，宽约4.5μm～6.0μm，微弯曲，近顶囊处稍膨大，光滑，无色；
b)顶囊:半球形，直径10μm～16μm；
c)小梗:双层，梗基长约5μm～7μm，宽约2.0μm～2.5μm，平行密集于顶囊顶部；瓶梗长约5.5μm～7.5μm，宽1.5μm～2.0μm；
d)分生孢子:球形或近球形，直径约2μm，表面光滑无棘；
e)菌核:不产生。 |