1　范围

    本标准规定了伪狂犬病的诊断方法。

    本标准适用于猪、羊、犬、猫等及其他易感动物伪狂犬病的诊断。其中病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、家兔接种试验适用于伪狂犬病病毒的检测；中和试验、酶联免疫吸附试验适用于非免疫动物伪狂犬病抗体的检测以及免疫后抗体水平的监测；胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的早期检测。

2　病毒分离鉴定

2.1　试验材料

    改良最低要素营养液(DMEM)培养基配方见附录A(标准的附录)，仓鼠肾细胞(BHK₂₁)或猪肾细胞系(PK—15)细胞，新牛犊牛血清，青霉素，链霉素，0.22um微孔滤膜，细胞培养瓶。

2.2　操作步骤

2.2.1　病料的采集：

对死亡病畜或活体送检并处死的动物，以无菌手术采集大脑、三叉神经节、扁桃体、肺等组织，冷藏送实验室检测。

2.2.2　样品处理：

待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DMEM培养液(见附录A)制成1：5乳剂，反复冻融三次，经3000r/min离心30min后，取上清液经0.22um微孔滤膜过滤，加入青霉素溶液至最终浓度为300IU/mL、链霉素为100ug/mL，-70℃保存作为接种材料。

2.2.3　病料接种：将病料滤液接种已长成单层的BHK₂₁细胞(或PK—15细胞)，接种量为培养液量的10％，37℃恒温箱中吸附1h，加入含10％新生犊牛血清(已经过56℃水浴灭活30min，过滤除菌，无支原体)的DMEM培养液，置37℃温箱中培养。

2.2.4　观察结果：

接种后36h～72h，细胞应出现典型的细胞病变效应(CPE)，表现为细胞变圆，拉网、脱落。如第一次接种不出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬病病毒检测阴性。

2.2.5　病毒的鉴定

将出现细胞病变的细胞培养物，用聚合酶链反应或家兔接种试验，或作进一步鉴定。

3　聚合酶链反应

3.1　试验材料

    蛋白酶K，十二烷基硫酸钠(SDS)，苯酚，三氯甲烷，异戊醇(分析纯)，溴化乙锭(EB)，TEN缓冲液[见附录B(标准的附录)]。

    引物：扩增伪狂犬病毒基因中434—651碱基对(bp)之间217bp基因片段，序列为：上游引物P1：5’一CAGGAGGACGAGCTGGGGCT—3’，下游引物P2：5’一GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT—3’。

3.2　操作步骤

3.2.1　样品的采集：对于病死或扑杀动物，取大脑和三叉神经节、扁桃体、肺等组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件下送实验室检测。

3.2.2　样品处理：  每份样品分别处理。采病料经组织研磨器充分研磨，按1：5用TEN缓冲液(见附录B中B1)悬浮收集于离心管内，反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻拭子，则加入2mLTEN缓冲液，充分挤压，取出棉试子，7000r/min离心5min，取上清液472.5uL，加入25uLl0％十二烷基硫酸钠(见附录B中B4)和2.5uL的20mg/mL蛋白酶K(见附录B中B3)，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚溶液500uL，涡旋20s，离心取上清液，加等量的酚：三氯甲烷：异戍醇(25：24：1)抽提一次，再用等量的三氯甲烷：异戍醇(24：1)抽提一次，最后用两倍的无水乙醇沉淀，真空抽干后加入20uL双蒸水溶解(此即为“模板”)，720℃贮存备用。

3.2.3　聚合酶链反应(PCR)的操作程序：先将制备的模板DNA置l00℃水浴10min作变性处理，然后立即放于冰浴中。PCR反应体系(按摩尔浓度计算)为：总体积25uL，含有50mol/L(氯化钾)(KCl)，l0mmol/L三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tils—HCl)(pH9.0)，0.1％三羟甲基氨基甲烷溶液(0.1％TritonX—100)，100umol/LdNTPs，0.35umol/L引物，2mol／L氯化镁(MgCl2)，及0.5U台克(Taq)DNA聚合酶，2ul模板DNA。

    最后加入矿物油约20uL覆盖。

    扩增条件为：94℃变性3min，进入循环，94℃60s，65℃60s，72℃60s,40个循环后72℃延伸5min。

3.2.4　PCR产物的检测：

将样品分别加于1％琼脂凝胶板的各样品孔中，有一孔加标准阳性样品，每孔10Ul—15uLPCR扩增产物，进行电泳，溴化乙锭(见附录B中B2)染色，在紫外光下观察结果。电泳区带迁移率与标准阳性样品区带迁移率相同的待检样品应判为阳性。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察并与标准分子量相对照，

阳性样品可出现140bp和77bp两个片段。

4　家兔接种试验

4.1　家兔的选择

    选择健康成年家兔，用血清中和试验、胶乳凝集试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验检测，证实为伪狂犬病抗体阴性。

4.2　病料的采集及处理

    无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用灭菌生理盐水配成1：5乳悬液，反复冻融2—3次后，以3000r/min离心10min，取上清液加入青霉素和链霉素溶液，最终浓度分别为I00IU/mL和l00ug/mL，置4℃冰箱中作用12h，作为待检样品。

4.3　病料接种

    将待检样品经颈部皮下注射接种，每只家兔接种1mL～2mL。

4.4　结果观察和判定

4.4.1　伪狂犬病毒感染阳性：被接种动物在接种后24h～48h注射部位出现奇痒，家兔啃咬注射局部，导致皮肤溃烂，家兔尖叫、口吐白沫，最终死亡。

4.4.2　伪狂犬病毒感染阴性：接种家兔仍健活，判为阴性。

5　血清中和试验

5.1　试验材料

    0.25％胰酶(胰蛋白酶250mg加入100mL汉克氏(Hanks)液中，充分溶解后，过滤除菌，－20E保存)，PK—15细胞；伪狂犬病阳性血清、阴性血清、伪狂犬病标准弱毒株；96孔细胞培养板。

5.2　操作步骤

5.2.1　病毒半数组织培养感染量(TCID₅₀)的测定

5.2.1.1　病毒培养和收获：

将伪狂犬病毒标准毒株接种于长成单层的PK—15细胞，接种量为培养液的十分之一，37℃培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。

5.2.1.2　病毒的滴定：

用DMEM培养液将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10^-1、10^-2……每个稀释度取100Ul。加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25% 胰蛋白酶消化的PK—15细胞悬液100ul(细胞含量以10⁵个ml，左右为宜)，每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照。置37℃5%二氧化碳培养箱中。

5.2.1.3　TCID₅₀计算

逐日观察细胞病变和对照，共观察3d-4d天，并记录细胞病变孔数。按照Red—Muench法计算病毒的冗助o[见附录E(提示的附录)]。

5.2.2　中和试验

5.2.2.1　血清的处理：将无菌采集的待检血清置56℃水浴灭活30min。

5.2.2.2　血清的稀释： 在细胞培养板各孔中加入50uLDMEM培养液，随后在第1孔中加入待检血清50ul混合后，用微量移液器取出50uL，加到第2孔中，混匀后取出50Ul。再加入第3孔中，依此类推直至第10孔(将混合液弃去50uL)，血清稀释度即为1：2、1：4、1：8……1：1024，每份待检血清稀释度作3个重复。

5.2.2.3　加入病毒：

将50uL含200个TCID₅₀的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃作用1h。

5.2.2.4　每血清孔中加人100uL经胰蛋白酶消化分散PK—15细胞悬液(细胞含量以10⁵个/ml左右为宜)。

5.2.2.5　设立对照组

5.2.2.5.1　病毒回归试验：

每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将200TCID₅₀/50mL病毒液作1、10、100、1000倍稀释，每个稀释度作4孔，每孔加100／ul病毒液，然后每孔100uLPK—15细胞悬液。

5.2.2.5.2　阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照。

5.2.2.6　结果观察：

逐日观察，记录病变和非病变孔数，共观察7天。病毒回归试验中0.1TC1D₅₀应不引起细胞病变，而100TCID₅₀应引起细胞病变，阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照成立，测定结果方有效，否则该试验不能成立。

5.2.3　计算抗体中和效价

    观察后确定能对细胞培养50% 保护的血清最大稀释度，计算抗体中和效价。如抗体效价为1：2及1：2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。

6　酶联免疫吸附试验

6.1　试验材料 

    抗原、酶标抗体、阴性血清、阳性血清；底物邻苯二胺—过氧化氢(OPD—H₂O₂)溶液，抗原包被液、封闭液、冲洗液、终止液配制方法见附录C(标准的附录)，酶标反应板。

6.2　操作步骤

6.2.1　 包被

    用包被液(见附录C中C2)将抗原稀释到工作浓度加入酶标板孔内、每孔100uL，37℃作用1h后置4℃冰箱过夜。

6.2.2　洗涤

    弃去孔内液体，用冲洗液(见附录C中C1)洗3次，每次3min，用吸水纸拍干。

6.2.3　封闭

    各孔加人封闭液(见附录C中C3)100uL37℃；作用1h。按6.2.2步骤洗涤。

6.2.4　加入待检血清和阴性、阳性血清对照

    待检血清经56℃30min灭活后，用冲洗液作1：40稀释，加入抗原孔中，每孔100uL；同时将阴性血清对照和阳性血清对照各加人三个抗原孔中，分别记为A₁，A₂，A₃和A₄，A₅，A₆孔。37℃作用1h，重复6.2.2步骤。

6.2.5　加入酶标抗体

    用冲洗液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔加入100uL，37℃作用1h，重复6.2.2步骤。

6.2.6　加入底物邻苯二胺—过氧化氢(OPD—H₂O₂)(见附录C中C4)

    每孔100ul，室温避光显色25min。

6.2.7　终止反应

    每孔加入50ul终止液(见附录C中C5)终止反应。

6.2.8　测定透光值(OD)值

    在酶联免疫检测仪上于490um波长处测定光吸收值。

6.2.9　结果的判定

6.2.9.1　阴性对照光吸收值(OD)3孔(A₁、A₂、A₃)的平均值(NC_X)按式(1)计算：

                     A₁OD₄₉₀+A₂OD₄₉₀+A₃OD₄₉₀

             NC_X=                                                               ⑴

                              3

6.2.9.2　阳性对照OD3孔(A₄、A₅、A₆)平均值(PCx)按式(2)计算：

                     A₄OD₄₉₀+A₅OD₄₉₀+A₆OD₄₉₀

             PC_X=                                                               ⑵

                              3

6.2.9.3　血清检测值与阳性对照血清检测值之比(S／P)值按式(3)计算：

                            样品A₄₉₀—NC_X

              S/P=                                                             ⑶　　　　　　　　　　PC_X －NC_X 

    如S/P≥0.5，则判为抗体阳性；如S/P<0.5，则判为抗体阴性。

7　胶乳凝集试验

7.1　试验材料

    伪狂犬病胶乳凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清，稀释液配制方法见附录D(标准的附录)。

7.2　操作步骤

7.2.1　对照试验

    取等量的胶乳凝集试验抗原(约20uL)分别与阴性血清、阳性血清在洁净的玻片上混合，如分别出现如下判定标准中的不凝集和等于或高于50％凝集，则对照组成立，可进行待检血清的检测。

7.2.2　待检血清处理

    待检血清不须热灭活或其他方式的灭活处理。

    待检血清的检测：将待检血清用稀释液(见附录D)作倍比稀释后，各取15uL与等量胶乳凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在3min～5min内观察结果。

7.2.3　判定标准

    可能出现以下几种凝集结果，即：

    100％凝集：混合液透亮，凝集颗粒聚集在液滴的边缘；

    75％凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集颗粒；

    50％凝集：凝集颗粒较细，液滴略浑浊；

    25％凝集：有少量凝集颗粒，混合液浑浊；

    0凝集：无凝集颗粒出现，混合液呈乳白色均匀一致的浑浊。

7.2.4　结果的判定

    以出现50% 凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价，其值≥1：2判为伪狂犬病抗体阳性，否则判为抗体阴性。如为阴性，可用血清中和试验或酶联免疫吸附试验进一步检测，可能出现以下三种结果：

    如为阴性，则判为伪狂犬病抗体阴性；

    如为可疑，建议在间隔2周后再检测，如这三种方法均为阴性或可疑，判为阴性；如这三种方法中任何一种方法为阳性，则判为阳性；

    如中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某一种方法为阳性，均可判为伪狂犬病抗体阳性。

附　录　A
（规范性附录）
DMEM(高糖)培养液的配制

A.1　量取去离子水950mL，置于一定的容器中。

A.2　将DMEM粉剂10g加于15℃一30℃的去离子水中，边加边搅拌。

A.3　每1000mL培养液加3.7g碳酸氢钠(Nail(HCO₃)。

A.4　加水至1000mL，用lmol/L(氢氧化钠)(NaOH)或盐酸(HCl)将培养液pH值调至低于pH6.9—7.0，在过滤之前应盖紧容器瓶塞。

A.5　立即用孔径为0.22um的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

附　录　B 

聚合酶链反应溶液的配制

(标准的附录)

B.1　TEN 缓冲液

氯化钙(CaCI₂)                                   11.00mg(1mmol/L)

三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tris—HCl)(Ph8.0)        1210.00mg(10mmol/L)

乙二胺甲乙酸(EDTA)(pH8.0)                       372.00mg(1.0mmol/L)

三蒸水                                          1000mL

B.2　溴比乙锭溶液

溴比乙锭                                        1.0g

三蒸水                                          100mL

磁力搅拌数小时以确保其溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

    注：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。

B.3　蛋白酶K(20mg/mL)(贮存液)

    三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.8)                     1.2mg(0.01mmol/L)

    乙二胺四乙酸(EDTA)                                1.86mg(0.005mmol/L)

    (SDS)                                             5.0g

    三蒸水                                            1000mL

    加入蛋白酶K，使成为20mg／ml，即为贮存液。使用浓度为50ug/mL。

B.4　10% 十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的配制

    在90mL水中溶解10g电泳级十二烷基硫酸钠，加热至68℃助溶，加入浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至100mL，分装备用。

附　录　C 

酶联免疫吸附试验溶液的配制

(标准的附录)

C.1　洗液

含0.05％吐温—20(Tween—20)pH7.4的磷酸盐缓冲液。

将下列试剂按次序加入1000mL体积的容器中，充分溶解即成。

氯化钠(NaCl)                                    8.0g

氯化钾(KCl)                                     0.2g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)                     0.2g

    磷酸二氢钾(KH₂PO4)                             2.9g

    吐温—20(Tween—20)                             0.5mL

    加蒸馏水至                                      1000mL

C.2　抗原包被液

    0.025mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液。

    碳酸钠(NaCO₂)                                  1.59g

    碳酸氢钢(NaHCO₃)                               2.93g

    蒸馏水                                          1000mL

C.3　封闭液

    冲洗液                                          100mL

    牛血清白蛋白(BSA)                             0.1g

C.4　底物溶液邻苯二胺—过氧化氢(OPD—H202)

C.4.1　0.1mol/LpH5.0磷酸盐—柠檬酸盐缓冲液

将下列试剂按次序加入1000mL体积的容器中，充分溶解即成。

磷酸氢二钠(Na2HP04．12H20)                   71.6g

柠檬酸                                        19.2g

蒸馏水                                        1000mL

C.4.2　底物溶液

    0.1mol/LpH5.0磷酸盐—柠檬酸盐缓冲液           100mL

    邻苯二胺(OPD)                                 40mg

    30％过氧化氢(H₂O₂)                            0.15mL

    此液对光敏感，应避免强光直射。现配现用。

C.5　终止液

    2mol/L硫酸(H₂S04)

    硫酸(H2SO₄)                                  22.2mL

    蒸馏水                                       177.8mL

附　录　D 

血清稀释液(0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液)

(标准的附录)

将下列试剂按次序加人1000mL体积的容器中：

氯化钠(NaCl)                              8.02g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)               3.87g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)                       0.163g

氯化钾(KCl)                               0.201g

加双蒸馏水至                             1000mL

混匀后，充分溶解，最后加入叠氮钠(NaN₃)防腐，其终浓度为万分之一。

附　录　E 

病毒半数组织培养感染量TCID₅₀的计算

 (提示的附录)

(按Reed—Muench法)

举例说明：                           表E1

    从表E1可见该病毒的TCID₅₀在10^-6 (以84.66％)和10^-7 (45.4％)之间，首先按式(E1) 计算距离比：

                            高于50%病变百分数—50

          距离比=                                                               (E1)

                    高于50%病变百分数—低于50%病变百分数

—1gTCID₅₀=高于50% 稀释度对数+距离比×稀释度对比

                            84.6—50

    代入公式：距离比=                   =0.88

                            84.6—45.4

—1gTCID₅₀=-6+0.88×(-1)=-6.88

    所以：TCID₅₀=10^—6.88/0.1mL

由于病毒的稀释倍数是10^-1倍，其稀释倍数的对数是(—1)，因此可将上式获得的距离比(0.88)加引起细胞病变孔数高于细胞培养孔数50％的病毒稀释度的对数(6)上，因此该病毒的TCID₅₀应是10^-6.88/0.1mL。