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1 范围
本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症(PRRS)的诊断方法。
本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。
2 诊断方法的种类和选用
PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可做出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(1PMA)、间接免疫荧光试验(1FA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测PRRS病毒抗体、IPMA、IFA和间接ELISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多适用于确定病性。SN反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断。
本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪PRRS的诊断方法，保证了我国对PRRS的诊断与国外的一致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1~2种方法即可。
3 病毒的分离与鉴定
3.1 材料准备
3.1.1 器材
96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(CO2)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2um的微孔滤膜、普通光学显微镜。
3.1.2 试剂：
RPMIl640营养液、犊牛血清、青霉素(104IU/mL)与链霉素(104ug/mL)溶液、7.5%碳酸氢销溶液等。
3.1.3 细胞培养物
猪原代肺泡巨噬细胞培养物(PAM)或MARC—145或HS2H细胞。PAM由无PRRS猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录B。MARC—145或HS2H细胞由国家指定单位提供。
3.1.4 样品
3.1.4.1 样品的采取和送检
在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水。对病死猪(如流产的死胎)和扑杀猪(如弱胎猪)，应立即采取肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放-25℃～-30℃冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。
3.1.4.2 样品的处理
血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合后使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMIl640营养液，制成10%悬液，3000r离心15min，吸取上清液，加入青霉素500IU/mL、链霉素500ug/mL、庆大霉素500ug/mL和两性霉素B2001ug/mL。怀疑有细菌污染的样品，也可用0.2um微孔滤膜过滤处理。
3.2 操作方法
3.2.1 稀释样品
取96孔细胞培养板每孔加入细胞培养液RPMIl640(含犊牛血清10%、青霉素100IU/mL、链霉素100ug/mL、庆大霉素50ug/mL、两性霉素B10ug/mL、Ph=7.2)90uL。在A1和C1孔内加入同一份已处理的样品各10uL(样品10×稀释)。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10uL分别移人B1和D1排孔内(样品100×稀释)。除第6和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖，置4℃冰箱内保存备用。
3.2.2 制备细胞板
已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMIl640稀释，使细胞终浓度为1×106细胞/ml。或将MARC—145或HS2H细胞用MEM细胞营养液稀释，细胞终浓度为5×104细胞/ml然后，在另一块96孔细胞培养板上海孔加入上述细胞悬液100uL。
按照上述操作，每板可检测20份样品，每份样品重复2个滴度。第6和第12列留作正常细胞对照(不接种样品)。
3.2.3 接种样品
由样品稀释板每孔内务吸取稀释的样品液50uL，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内(第一代)。细胞板加盖后，放入37℃5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用(CPE)，连续观察2d~5d。CPE通常在接种后ld~4d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。
3.2.4 培养物盲传
根据第一代培养物CPE出现的情况(通常在接种后的第2d~3d)安排盲传。盲传时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25uL，移入新细胞板相应的孔内。再于37℃5%二氧化碳保温恒温箱中培养2d~5d，每天观察CPE。
3.3 结果的判断和解释
在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验(1PMA)或间接免疫荧光试验(1FA)进行终判；只要对PRRS病毒阳性血清呈现阳性反应，则被认定为PRRS病毒分离阳性。
4 免疫过氧化物酶单层试验(1PMA)
4.1 材料准备
4.1.1 器材
微量移液器、倒置显微镜等。
4.1.2 试剂
4.1.2.1 IPMA诊断板的制备
见附录B。
4.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明令规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
4.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显色广底物溶液依照附录A自行配制。
4.1.3 样品
采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀液作20倍稀释。
4.2 操作方法
参照图1。
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1 |
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C |
C |
S6 |
S6 |
S6 |
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P |
P |
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S7 |
S7 |
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C |
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N |
N |
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S1 |
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S2 |
S2 |
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S3 |
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S4 |
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S5 |
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V+ |
V+ |
V- |
V+ |
V+ |
V- |
V+ |
V+ |
V- |
V+ |
V+ |
V- |
V+—感染PRRS病毒的细胞列：V-—未感染PRRS病毒的细胞列；
C—空白对照孔；P—标准阳性血清对照孔；N—标准阴性
血清对照孔；S1、S2、S3等—被检血清编号
图1 1PMA和IFA诊断板加样示意图
4.2.1 取已作20倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔(V+)及其后的1个未感染细胞孔(V-)内(参照图1)，每孔50uL，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于4℃条件下过夜。
4.2.2 弃去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100ul，每次1min~3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。
4.2.3 每孔加人工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50uL，封板后放在保湿盒内于37℃恒温箱中感作60min。
4.2.4 弃去板中液体，洗涤三次，方法同4.2.2。
4.2.5 每孔加入显色/底物溶液50uL,封板于室温(18℃~24℃)下感作30min。
4.2.6 弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.2.2，再用三馏水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。
4.3 结果判定与解释
将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔(P．V+)和未感染细胞孔(P·V-)均应为阴性反应；标准阳性血清对照感染细胞孔(P·V+)应呈典型阳性反应，未感染细胞孔(P·V-)应为阴性反应；标准阴性血清对照感染细胞孔(N·V+)和未感染细胞孔(N·V-)均应呈阴性反应；被检血清未感染细胞孔(V-)不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆(可能仅见于部分细胞)出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA(十)；无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA(—)。IPMA(+)者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。
5 间接免疫荧光试验(IFA)
5.1 材料准备
5.1.1 器材
荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。
5.1.2 试剂
5.1.2.1 IFA诊断板的制备：见附录B。
5.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄(FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。
5.1.3 样品
采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释。
5.2 操作方法
5.2.1 取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100uLPBS液洗一次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。
5.2.2 在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2个及其后无感染细胞孔1个，每孔100uL，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37℃恒温箱中感作45min。
5.2.3 弃去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100uL，每次3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。
5.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50uL，在37℃恒温箱中感作45min。
5.2.5 弃去板中结合物，同5.2.3方法洗涤3次后，最后在吸水纸上轻轻拍干。
5.3 荧光显微镜检查及判定与解释
荧光显微镜采用蓝紫光(激发滤板通常用BG12，吸收滤板用OGl或GG9)，在5倍~10倍目镜下检查。标准阳性血清对照中感染细胞孔(P·V+)应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔(P?V-)不应出现特异性荧光；标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔(N·V+)和未感染细胞孔(N·V-)均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔(C·V-)不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔(N·V+)出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阳性；否则，判为阴性。
6 间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)
6.1 材料准备
6.1.1 器材
96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。
6.1.2 试剂
6.1.2.1 PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。
6.1.2.2 兔抗猪IgG；辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
6.1.2.3 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
6.1.2.4 抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制。
6.1.3 样品
采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。
6.2 操作方法
参照例2。
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1 |
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A |
P |
P |
S3 |
S3 |
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B |
P |
P |
S3 |
S3 |
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C |
N |
N |
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N |
N |
S4 |
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S5 |
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S1 |
S1 |
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S5 |
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S2 |
S6 |
S6 |
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S2 |
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S6 |
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V |
C |
V |
C |
V |
C |
V |
C |
V |
C |
V |
C |
V—为PRRS病毒抗原包被列；C—正常细胞抗原包被列；
P—标准阳性血清对照孔；N—标准阴性血清对照孔；
S1、S2、S3等一被检血清编号
图2 间接ELISA诊断板加样示意图
6.2.1 包被抗原：
取96孔平底微量反应板，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工作浓度的对照抗原，每孔100ul(参照图2)，封板，置保湿盒内放37℃恒温箱中感作60min，再移置4℃冰箱内过度。
6.2.2 洗板：
弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔100ul，洗涤3次，每次1min。在吸水纸上轻轻拍干。
6.2.3 封闭：
每孔加入封闭液100ul，封板后置保湿盒内于37℃恒温箱中感作60min。
6.2.4 洗涤：
方法同6.2.2。
6.2.5 加血清：
反应板按图2编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100uL。封板，置保湿盒内于37℃恒温箱中感作30min。
6.2.6 洗板：
方法同6.2.2。
6.2.7 加酶标抗体
每孔加工作浓度的酶标抗体100uL，封板，放保湿盒内置37℃恒温箱中感作30min。
6.2.8 洗板：
方法同6.2.2。
6.2.9 加底物：
每孔加入新配制的底物溶液100uL，封板，在37℃恒温箱中感作15min。
6.2.10 加终止液
每孔添加终止液100uL终止反应。
6.3 光密度(OD)值测定与计算
6.3.1 OD值测定：在酶标测定仪上用=650nm读取反应板各孔溶液的OD值，记入专用表格。
6.3.2 OD值计算
按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值。
标准阳性血清(P)与病毒抗原(V)反应的均值P?V(OD650)按式(1)计算：
P·V(OD650)=[A1(OD650)+B1(OD650)]/2……………………………（1）
标准阳性血清(P)与对照抗原(C)反应的均值P·C(OD650)按式(2)计算：
P·C(OD650)=[A2(OD650)+B2(OD650)]/2……………………………（2）
标准阴性血清(N)与病毒抗原(V)反应的均值N·V(OD650)按式(3)计算：
N·V(OD650)=[C1(OD650)+D1(OD650)]/2……………………………（3）
被检血清(S)与病毒抗原(V)反应的均值S·V(OD650)按式(4)计算：
S·V(OD6650)=[E1(OD650)+F1(OD650)]/2 (以S1血清为例)………（4）
被检血清(S)与对照抗原(C)反应的均值S·C(OD650)按式(5)计算：
S·C(OD650)=[E2(OD650)+F2(OD650)]/2 (以S1血清为例)………(5)
6.3.3 按式(6)计算被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S／P：
S/P=[S·V(OD650)—S·C(OD650)]／[P·V(OD650)—P·C(OD650)]………(6)
6.4 结果的判定与解释
6.4.1 有效性判定：
P?V(OD650)与N·V(OD650)的差值必须大于或等于0.150时，才可进行结果判定。否则，本次试验无效。
6.4.2 判定标准与解释
a)S/P比值小于0.3，判定为PRRS病毒抗体阴性，记作间接ELISA(—)。
b)S/P比值大于或等于0.3，小于0.4，判定为疑似，记作间接ELISA(±)。
c)S/P比值大于或等于0.4，判定为PRRS病毒抗体阳性，记作间接ELISA(+)。
间接ELISA(+)者表明被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。
7 血清中和试验(SN)
7.1 材料准备
7.1.1 器材：
96孔细胞培养板、微量移液器、二氧化碳(CO2)恒温箱、倒置显微镜等。
7.1.2 病毒：
美洲标准株ATCC VR—2332或欧洲标准株LV，由国家指定单位提供。使用前按附录C方法滴定病毒效价后，用含20%健康猪新鲜血清的EMEM营养液(pH7.2)将其稀释至200TCID50/25uL，作为工作病毒液。
7.1.3 细胞：
MARC—145或HSH传代细胞，由国家指定单位提供。使用时，用细胞分散液消化、分散细胞，计数，再用EMEM营养液(含犊牛血清10%，青霉素1001U/mL，链霉素100ug/mL，pH=7.2)稀释至106细胞/ml。
7.1.4 试剂：
7.1.4.1 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供，使用前经56C灭活30rain，并按说明书规定进行稀释。
7.1.4.2 健康猪新鲜血清：无菌采自3～8月龄的无PRRS的健康猪，可于-70℃低温冰箱保存。使用时不灭活。
7.1.5 样品：
无菌采集被检猪血清，血清必须新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C保存或立即送检，检测前经56℃灭活30min。由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒感染后2—3周时采集为宜。
7.2 操作方法
参照图3。
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5 |
6 |
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10 |
11 |
12 |
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A |
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C |
C |
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